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黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條性能評估測試

時間：2018-01-25來源：上海飛測點擊量：

      摘要：對上海飛測生物科技有限公司研發(fā)生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條在糧食谷物飼料中的檢測性能進行了評估。該產(chǎn)品的最低檢出限（LOD）為0.29μg/kg，最低定量限(LOQ)為0.91μg/kg，線性范圍為1.00-50.00μg/kg，線性范圍內(nèi)的添加回收率為92.89%~121.07%，3次重復的變異系數(shù)在14.56%以內(nèi)。與其他真菌毒素的交叉反應率均小于5%。該產(chǎn)品具有操作簡便、靈敏準確、快速定量、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，適合用于對糧食谷物飼料中黃曲霉毒素B1的進行快速定量測定。 

關鍵詞：黃曲霉毒素B1檢測試紙條；熒光定量免疫層析；黃曲霉毒素B1；糧食谷物飼料 


      黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1簡寫為AFB1）是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，含有一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰酮（香豆素），具有強致癌性以及劇毒性，是迄今發(fā)現(xiàn)的各種真菌毒素中最穩(wěn)定的一種。從1993年開始黃曲霉毒素被認定為世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機構劃定的一類致癌物，是世界公認的三大強致癌物質(zhì)之一，而黃曲霉毒素B1由于毒性最大，污染最重，是危害最大的一種黃曲霉毒素。 

      黃曲霉毒素B1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品，且以南方高溫、高濕地區(qū)受污染最為嚴重。目前，GB 2761-2011《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》中對糧食谷物及其制品中黃曲霉毒素B1的最高限量為20μg/kg。GB13078-2001《飼料衛(wèi)生標準》中對不同種類的飼料中黃曲霉毒素B1的最高限量標準從10-50μg/kg。 

      目前，國標法測定黃曲霉毒素B1采用HPLC法，需要大型的儀器設備，價格昂貴，操作過程復雜、時間較長，且無法在現(xiàn)場和基礎小型實驗室使用。除此之外，也有采用黃曲霉毒素酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金快速檢測試紙條用于大量樣品的篩查，操作簡便，檢測快速，成本也較低，但準確性和重復性較差，容易造成假陽性或者假陰性。因此，急需一種既簡便快速，又能準確定量的檢測方法，熒光定量免疫層析正好可以滿足這種需求。本文通過對多種糧食谷物飼料樣品的實測，驗證了上海飛測生物開發(fā)的黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測試紙條的技術性能。 

1實驗材料和方法 

1.1試劑和材料 

      除注明外，均為分析純，試驗用水均為UP水。 
      黃曲霉毒素B1熒光熒光定量檢測試紙條（由包被有熒光微球標記黃曲霉毒素B1抗體的乳膠墊、噴涂有黃曲霉毒素B1抗原的檢測線和噴涂有羊抗雞二抗的控制線的NC膜、樣品墊及吸收墊組成）、樣品提取液、樣品稀釋液、標準曲線ID卡及標準曲線條形碼均由上海飛測生物科技有限公司提供。

      黃曲霉毒素B1及其他真菌毒素的標準品：購自Sigma公司； 大米、玉米、小麥、面粉等樣品從超市購得或從企業(yè)取樣。 麩皮，小麥、面粉等飼料樣品從飼料廠和企業(yè)取樣。 

1.2儀器與設備  

      FD-100型熒光免疫定量分析儀和FD-5000型試紙條恒溫孵育器，上海飛測生物科技有限公司提供；低速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；漩渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平：Sartorius； 

1.3試驗方法 

1.3.1樣品的前處理  

      取具有代表性的待測樣品500g，用小型粉碎機粉碎1min后過20目篩，收集過篩的細小樣品。稱取1.0±0.02g過篩的樣品于10mL離心管中，加入5mL提取液，用漩渦混勻儀震蕩5min(或者搖床振蕩10min）后，4000RPM離心1min，取上清。  

1.3.2檢測過程  

      取50μL離心上清液加入500μL樣品稀釋液中，用漩渦混勻器混勻3-5s，然后取100μL加入到黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條的加樣孔中，置于37℃恒溫孵育器中溫育10min后，將試紙條插入熒光免疫定量分析儀中讀數(shù)，即為樣品的實際檢測濃度。當檢測值大于50μg/kg時，可用提取液將離心上清液稀釋5倍后再進行檢測，所得讀數(shù)值乘以對應的稀釋倍數(shù)即為最終的檢驗結果。  


2檢測結果分析 

2.1線性范圍與檢出限  
      在樣品提取液中，分別添加1.00μg/kg、2.50μg/kg、5.00μg/kg、10.00μg/kg、25.00μg/kg、50.00μg/kg 的黃曲霉毒素B1標準品，用上海飛測生物黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條每個樣品檢測3次，以添加濃度為為縱坐標，以熒光定量檢測試紙條的檢測結果為橫坐標，擬合曲線并計算線性相關系數(shù)，結果如下：

圖1 黃曲霉毒素B1標準品添加與熒光定量試紙條檢測值的線性關系  

      計算得出小麥的線性范圍：1.00～50.00μg/kg（6點）， 回歸方程: y = 1.042x + 0.540,相關系數(shù)R2 =  0.998；（見圖1）。  取10個無污染（陰性）小麥樣品、10個無污染（陰性）玉米樣品和10個無污染（陰性）大米樣品，用上海飛測生物黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條每個樣品檢測3次，檢測限（LOD）為測定平均值加3倍標準偏差，定量限(LOQ)為測定平均值加10倍標準偏差。測試結果表明，黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條的LOD為0.29μg/kg，LOQ為0.91μg/kg。  2.2準確性和重復性分析  在用國標法測定為0的不同種類空白樣品中分別添加黃曲霉毒素B1濃度為1.00，2.50，5.00，10.00，25.00，50.00μg/kg的標準品，然后按照黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條的檢測方法進行檢測。
檢測結果見表1。  

表1  不同樣本檢測的準確性和重復性


      從表1可以看出，上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條測試不同糧食谷物中黃曲霉毒素B1的添加回收率在92.89%~121.07%，3次重復的變異系數(shù)在14.56%以內(nèi)。

 2.3與色譜方法的對比試驗結果 
      取大米、小麥、玉米、高粱、花生、麩皮、噴漿玉米、DDGS、豆粕受污染樣品各1份，先采用國標液相色譜法進行測定，再使用上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條進行測定，各測試3個平行樣。檢測結果如下： 
表2  黃曲霉毒素B1熒光定量檢測卡與高效液相色譜法檢測值對比 

      表2表明，在不同的糧食谷物飼料中，上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條與液相色譜法的符合率為89.89%~112.65%，3次重復測定的的CV值在10.29%以內(nèi)。 2.4方法特異性 

      選擇其他5種常見的真菌毒素的標準品在陰性玉米中進行添加，添加的濃度為100 μg/kg，然后用飛測生物黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條進行測試，每個樣品測3次取平均值；結果顯示與赭曲霉毒素A，伏馬菌素B1，嘔吐毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮交叉反應率均＜5%。實驗結果表明，黃曲霉毒素B1膠體金試劑條對伏馬毒素、赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、玉米赤霉毒素幾乎無交叉反應，其方法特異性可以能滿足檢測要求。

表3 交叉反應率表


3結論 
     本實驗采用上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條對不同的糧食谷物飼料樣本進行測試，該產(chǎn)品的最低檢出限（LOD）為0.29μg/kg，最低定量限(LOQ)為0.91μg/kg，線性范圍為1.00-50.00μg/kg，線性范圍內(nèi)的添加回收率為92.89%~121.07%，3次重復的變異系數(shù)在14.56%以內(nèi)。與其他真菌毒素的交叉反應率均小于5%。其準確性和可靠性均可以滿足歐盟和我國對黃曲霉毒素B1的分析標準的技術要求。該方法具有簡便快速、準確可靠、重復性好等特點，可用于不同糧食谷物飼料中黃曲霉毒素B1的快速定量檢測分析。

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