小麥?zhǔn)召忂^程中嘔吐毒素檢測方法的探討

嘔吐毒素主體成分為DON（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇），屬于單端孢霉烯族化合物，主要由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、雪腐鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生。由于她可以引起豬的嘔吐，故又稱嘔吐毒素。研究表面，DON化學(xué)性能非常穩(wěn)定，一般不會在加工、儲存以及烹調(diào)過程中破壞，121℃高壓加熱25min僅有少量破壞，烘培溫度210℃，油煎溫度140℃或煮沸，只能破壞50%。含有嘔吐毒素谷物類加工產(chǎn)品，在加工過程中，由于技術(shù)限制不可能完全去除，人食用含有一定量的嘔吐毒素糧油食品后，會出現(xiàn)胃部不適、眩暈、腹脹、頭痛、惡心、嘔吐，手足發(fā)麻、全身乏力、顏面潮紅、以及食物中毒性白細(xì)胞缺乏癥。嘔吐毒素主要通過胃腸道吸收，經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入肝臟代謝后經(jīng)腎臟隨尿液排出，造成各器官的廣泛損傷。它在人體中的半衰期為2-4h，代謝迅速，8h后就檢測不到嘔吐毒素和它的代謝物。

嘔吐毒素可在人和動物體內(nèi)蓄積，具有致畸性、神經(jīng)毒性、胚胎毒性和免疫抑制作用。嘔吐毒素的產(chǎn)物菌株適宜在陰涼、潮濕的條件下生長，廣泛存在于大麥、小麥、玉米和燕麥中。

我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》中規(guī)定，小麥粉、小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇限量標(biāo)準(zhǔn)為1000μg/kg。

由于嘔吐毒素對人體具有較大的傷害，近年來相關(guān)部門加大了對市場中面粉等食品的嘔吐毒素含量檢測，在檢測中一些面粉加工企業(yè)的部分批次產(chǎn)品被檢出嘔吐毒素含量超標(biāo)，相關(guān)產(chǎn)品面粉加工企業(yè)只能回收處理，給企業(yè)造成較大的損失。而面粉中的嘔吐毒素主要來自于小麥，且在面粉加工過程中，對嘔吐毒素沒有有效的去除方法，只能通過控制小麥中的嘔吐毒素含量來保證面粉中的嘔吐毒素含量不超標(biāo)。因此面粉加工企業(yè)紛紛加強(qiáng)了對采購小麥的嘔吐毒素含量控制。

目前對嘔吐毒素國內(nèi)常用的檢測方法主要有以下幾種：高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、膠體金免疫層析法、熒光定量免疫層析法。

?  主要試劑與儀器

高效液相色譜儀；天平；粉碎機(jī)；移液器；免疫親和柱；甲醇；聚乙二醇。

?  嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

臨用前將高濃度嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用流動相逐步稀釋配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

?  提取凈化

準(zhǔn)確稱取25g均勻樣本于250ml規(guī)格三角燒瓶中，加5g聚乙二醇，加入125ml去離子水，于往復(fù)式振蕩器劇烈震蕩20min。用快速濾紙過濾，收集濾液于15ml離心管中；再將濾液經(jīng)微纖維素濾紙過濾，收集濾液于新離心管中作為上清液。取2.5ml上清液以1-2滴/s的速率將其通過免疫親和柱，直至空氣吹出柱內(nèi)的全部液體，再用10ml去離子水以1-2滴/s的速率洗滌親和柱，直至空氣吹出柱內(nèi)的全部液體。最后用2ml甲醇以1滴/s的流速淋洗親和柱，收集濾液于玻璃試管中，在50-60℃加熱條件下氮?dú)獯蹈?，然后用流動相?fù)溶。用高效液相色譜進(jìn)行測定，根據(jù)峰保留時間定性，根據(jù)峰面積外標(biāo)法定量。

?  實(shí)際操作過程的優(yōu)缺點(diǎn)

?  主要試劑與儀器

酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、移液器、嘔吐毒素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

?  測定步驟

●    根據(jù)樣本檢測數(shù)插入相應(yīng)數(shù)量的酶標(biāo)板微孔于反應(yīng)板支架上，標(biāo)記好標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，然后加入200μL左右稀釋好的洗滌液，放置1min，倒掉液體后拍干。

●    在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入50μL各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，在樣品孔中加入50μL樣品液。每孔都加入50μL稀釋后的DON抗體溶液，混合搖勻，在37℃恒溫箱中孵育60min。

●    孵育結(jié)束后甩掉微孔中的液體，然后每孔加入250μL稀釋后的洗滌液，放置1min倒掉液體，倒掉液體后用力拍干。每孔分別加入100μL稀釋后的酶標(biāo)二抗溶液，在37℃恒溫箱中孵育30min。

●    孵育結(jié)束后甩掉微孔中的液體，然后每孔加入250μL稀釋后的洗滌液，放置1min倒掉液體，倒掉液體后用力拍干。每孔分別加入50μL顯色劑和50μL反應(yīng)底物，輕輕搖勻，在37℃恒溫箱中顯色反應(yīng)15min。

●    顯色反應(yīng)結(jié)束后每孔加入50μL終止液，用酶標(biāo)儀在450nm處進(jìn)行測定（必須在加入終止液后10min內(nèi)完成測定）

●    用酶標(biāo)儀在450nm處測定的標(biāo)準(zhǔn)品孔的光吸收值以及對應(yīng)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量樣本中嘔吐毒素含量。

?  實(shí)際操作過程的優(yōu)缺點(diǎn)

?  主要試劑與儀器

粉碎機(jī)、離心機(jī)、電子天平、嘔吐毒素膠體金檢測卡、純凈水、樣本稀釋液

?  樣本前處理

●    稱取0.5g有代表性的粉碎后的樣品，加入4ml純凈水提取。

●    用力震蕩5min，離心機(jī)4000RPM離心2min。

?  檢測步驟

●    用吸管吸取0.6ml上清液到小燒杯中，吹干濾液，然后用0.3ml體積稀釋液復(fù)溶杯底固體。

●    取出試紙，用滴管向試紙孔緩慢而準(zhǔn)確地逐滴加入3滴檢測液。

●    根據(jù)試紙上C、T線的顯色情況來判斷嘔吐毒素含量是否高于檢測限。

?  實(shí)際操作過程的優(yōu)缺點(diǎn)

?  主要試劑與儀器

真菌毒素?zé)晒舛靠焖贆z測箱（內(nèi)含恒溫孵育器、快速檢測儀等）、嘔吐毒素?zé)晒舛靠焖贆z測卡、嘔吐毒素樣品稀釋液、純凈水

?  樣本前處理

●    稱取5g有代表性的粉碎后的樣品，加入25ml純凈水提取。

●    渦旋振蕩器振蕩5min，離心機(jī)4000rpm離心2min。

●    取100μl上清液加入到1000μl樣品稀釋液中配成待測液，混勻備用。

?  檢測步驟

●    將孵育器、檢測儀開機(jī)，設(shè)定相關(guān)參數(shù)，并插入本批次產(chǎn)品ID卡。

●    取出檢測卡，水平放置于恒溫孵育器上。

●    用移液器吸取100μl待測液，加入到檢測卡的加樣孔中，計時8min孵育。

●    8min后將檢測卡插入熒光定量快速檢測儀中，按讀數(shù)鍵讀數(shù)。

●    定量檢測結(jié)果將呈現(xiàn)在快速檢測儀的顯示屏上，可準(zhǔn)確知曉嘔吐毒素含量。

?  實(shí)際操作過程的優(yōu)缺點(diǎn)

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